新型冠状病毒检测

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新型冠状病毒的爆发

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫情对中国的影响是巨大的，中央指导组（2月20日）甚至称这是建国以来前所未有的战役，而此时此刻我们正处于这一战役时期。截止今日(2020年2月22日)，中国有确诊76395例，重症11477例，死亡2348例；国外的数字也在攀升，已有1404例确诊，特别是日韩和伊朗的情况不容乐观。另一方面，目前全国以全方位的努力遏制疫情发展，效果也在显现。

从事件的前期处理来看，确有不少争议事件。但另一面，对病毒的科学研究角度，中国科学家以惊人的速度确定了病原体，并且测定了病毒的全基因组，受到各国科学家和世界卫生组织（WHO）的肯定。从新冠病毒的快速检测技术上，中国的实力同样是领先的。当然检测技术本身，仍有进步的空间。快速诊断对于疾病的管控和治疗非常关键。

此文就以本人，作为CRISPR-Cas12快速检测（HOLMES）发明人之一的经验，谈一谈新冠病毒检测相关的一些大家关心的问题。欢迎大家在留言区留言讨论。

图片来自腾讯和丁香园统计

新型冠状病毒的特征

在具体介绍检测方法之前，有必要介绍下病毒本身。新型冠状病毒，世界卫生组织（WHO）最近将其命名为SARS-CoV-2，旧称2019-nCoV，其导致的疾病称为COVID-19，当然，关于其命名，仍有争议，最后的定名需要国际病毒分类委员会开会正式决定（可能在今年6月）。本文中暂且仍称为SARS-CoV-2，中文名仍然是新型冠状病毒。

新型冠状病毒属于β属冠状病毒，有包膜，外形如下图（直径60-140 nm）。其遗传物质是单条正义RNA链，接近3万个碱基的长度。与SARSr-CoV和MERSr-CoV同属于同一家族，目前最接近的是蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45），有85%以上的同源性。

新型冠状病毒的RNA核心外，由蛋白质外壳包裹，表面突出的是刺突蛋白（S Protein），它是侵染宿主细胞关键。前天（2月20日），《科学》杂志发文，科学家利用冷冻电镜技术解析了刺突蛋白的分子结构，并发现它跟SARS病毒一样，与人体细胞的ACE2受体作用从而入侵细胞。但它与ACE2的亲和力是SARS病毒的10~20倍，这很可能是导致高度传染性的原因。

新型冠病毒检测方法

100多年前，还没有病原体检测这一说法，因为当时对于微生物，特别是病毒还知之甚少。第一次发现病毒是在19世纪末，伊万诺夫斯基(D. Iwanowski)推测了烟草花叶病毒的存在，而直到20世纪40年代，电子显微镜的发明才使得人类看到了它。

对于细菌和疾病之间的科学验证方法，是德国科学家科赫（Robert Koch）在1890年提出的科赫法则，当然这一法则也同样适用于病毒。大致过程是这样的，可从得病宿主身上体外纯培养病原微生物，这种纯培养微生物能感染新的健康宿主，且发生同样疾病，并能再次分离出该微生物。虽然这一法则在一定情况下仍然适用于临床诊断，但对于快速检测病原体的需求来说，显然需要其他确诊办法。

现代最常用的病原体快速检测技术主要是两大类，一类是核酸的检测，另一类是抗原抗体的检测。核酸（DNA或RNA）是病毒的遗传物质，任何物种都有独一无二的核酸序列，那么对它特征序列的检测即可确定病原体。抗原是能激发人免疫反应产生抗体的任何物质，比如病毒的特征蛋白质是抗原，而人体免疫系统产生用来专门对抗该抗原的另外一种蛋白质就是它对应的抗体。这一组抗原抗体可以特异性相互结合的特性可以作为检测的理论基础。

新冠病毒的检测也无非是这两大类，那么下面对这些方法做个简要介绍和对比。

核酸

测序技术可直接解读出核酸碱基的排列顺序，DNA是ATGC、RNA则为AUGC的顺序，新冠病毒接近3万个碱基，比人类少多了，人基因组差不多是30亿。对于一个完全未知的新病毒来说，测序技术是必须的。但通常来说，对病毒的全部序列测序需要相对昂贵的仪器、较长的时间，且需要专业生物信息学人对其解读。

测序技术虽然早在1977年就已发明，但在“人类基因组计划”的末期（20世纪末），该技术瓶颈得到重要突破，并开始迅猛发展。据了解，2003年SARS的鉴定耗时5个多月、2013年H7N9为1个多月，而对新冠病毒的全基因组测序仅仅5天。

现在有少数企业已研制出新型冠状病毒核酸测序试剂盒的生产，比如，杭州杰毅生物、达安基因等。小编认为，仪器成本等各方面要求太高，测序技术还不适用于大规模检测用，但前景可期。

PCR（聚合酶链式反应）技术发明于1983年，这一体外扩增核酸序列的技术在当今几乎任何一个分子生物学实验都会用到。PCR拓展了各种应用，包括目的核酸的扩增、DNA片段的连接、突变等，以及这里重点介绍的检测。PCR技术应用之前，首先得要知道病原体的基因序列，找到它的特征序列，设计引物。然后，用变温的方式将双链打开、引物结合、延伸，经30个左右的温度循环，可使目的片段得到指数级的扩增。那么，反推可知，能检测到大量DNA目的片段的即是阳性样品。（当然，RNA样品需要逆转录酶转换成DNA）。DNA扩增产物验证可通过琼脂糖凝胶电泳验证，但这种操作一是麻烦、二是开盖容易造成产物的气溶胶污染。目前，也可以荧光物质、或荧光探针杂交法检测扩增产物。

第二代PCR技术是目前新冠病毒检测方法的主流方法。它在反应体系中加入了荧光物质，通过专门的仪器，可实现实时荧光检测，方便了结果读取过程，也防止开盖后造成可能的污染，该技术也可对模板进行定量计算。另外，为了增加灵敏度和特异性，该技术还有不少改进版本，比如Taqman探针法、双重或多重荧光PCR等。这一方法，是目前官方的测定方法。国内根据此方法研发试剂盒的公司也是最多的，已经多达数百家，不过呢，过审批的只有7家（后文还会进一步探讨）。

第三代PCR是数字PCR技术，它将一小管（50微升左右）分割成了近10万个液滴，单一液滴为独立的反应单元，反应完成后读取每一单元的扩增情况（荧光），从而最终可实现模板DNA的绝对定量。现在这样技术试剂和机器相当昂贵（一台仪器近百万元），对新冠病毒快速检测的优势不大。不过国内也有几家公司开发了基于此的试剂盒。

图片来自biorad公司

PCR技术需要快速精准的升降温过程仪器，这类仪器相对昂贵，而等温扩增技术仅使用一个温度，对仪器的要求很低。等温扩增的方法有多种，但总的来说，这些技术主要分为2大类，一类是利用特殊的酶取代了PCR中高温解链的步骤，比如LAMP技术中的链置换DNA聚合酶和RPA中的重组酶、单链结合蛋白和链置换酶；另一类涉及到DNA和RNA之间的相互转换来扩增，比如NASBA和TMA用到的逆转录酶和RNA聚合酶。

小编总结了常见的几种等温扩增方法（见下表，不完全统计）。等温技术灵敏度和反应时间上，并不输给PCR。但等温扩增也有问题，首先是对引物的设计要求比较高，比如开发LAMP技术的日本荣研公司开发了专门设计LAMP引物的软件以应对复杂的设计，即使是这样，扩增的序列也不是任何区域都能设计得出来，而且实际效果要反复测试。另外，像RPA这种方法，较低温下的扩增反应，引物的非特异性结合的可能性会增加，容易造成假阳性。

此前，发明LAMP的日本荣研公司将其技术应用于结核分枝杆菌（TB）的检测，得到了WHO的认可和推荐，最近该公司也在全力研发对新冠病毒检测的试剂盒。在国内，杭州优思达在等温扩增的技术上也是领先的，其技术为交叉引物恒温扩增技术。其原理关键同样是链置换酶，只是引物设计策略与LAMP不同。此前，小编参观过该公司，从取样到出结果的一体化快速检测耗材与仪器是它的优势。最近，也被国家列为新冠病毒快速检测的紧急审批9个产品之一。

CRISPR技术的广泛为众人知晓，是它在基因编辑领域的叱咤风云。实际上，CRISPR也可用于检测，最初是2017年由张锋团队开发的基于CRISPR-Cas13的检测RNA的技术，称为SHERLOCK（Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），该方法原理是Cas13蛋白在人工设计的gRNA引导下，结合特异性RNA序列后，产生反式切割RNA探针的活性。而后不久，小编在内的中科院和吐露港公司开发了基于 CRISPR-Cas12的技术，注册专利并发文，命名为HOLMES（one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System），它专用于检测特异性DNA。当然，DNA和RNA之间很容易实现相互转换，因此这两个技术对于DNA和RNA都可检测。该技术被《科学》誉为下一代分子诊断技术。

需要指出的是，单独使用CRISPR检测技术通常达不到临床检验的灵敏度，因此需要结合扩增技术来提高灵敏度。CRISPR检测技术理论上可进一步提高单独使用扩增方法的灵敏度和特异性。目前，张锋等人公开了新冠病毒的CRISPR检测法（结合RPA扩增和试纸条）。

在国内也有几家公司开发了基于CRISPR的检测技术，包括吐露港和华大合作的CRISPR法检测仪。但这些都还需要临床样本的实际效果检验。

得提一句，Doudna等人也发表了基于Cas12的山寨版检测方法，称为DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）。值得高兴的是，就在最近，吐露港公司和张锋团队达成了协议，实现专利互享。

抗原抗体

对于人们熟悉的试纸检测（1条红线阴性，2条红线阳性），大多数都是基于抗原抗体的胶体金原理。新型冠状病毒的检测也可作为试纸条来检测。

比如，新型冠状病毒表面带有多种结构蛋白，这些蛋白包括多个抗原表位，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗体检测抗原的存在，从而直接证明样本中含有新型冠状病毒。

除了直接测病毒抗原，另一种方法是测血液中人体内产生的抗体。在病毒感染人体后，刺激免疫细胞产生特异性抗体，同样利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗原检测抗体的存在，从而间接证明人体已感染新型冠状病毒。检测的抗体主要分为IgM和IgG两类。目前对新型冠状病毒的这两类抗体的产生和持续时间还没有系统性研究，不过通常情况下，符合下图的规律。IgM抗体产生早，一经感染，快速产生，维持时间短，消失快，血液中检测阳性可作为早期感染的指标。IgG抗体产生晚，维持时间长，消失慢，血液中检测阳性可作为感染和既往感染的指标。

该方法检测只需十几分钟，无需特殊仪器，但目前灵敏度和特异性有限，同时几乎无法检测潜伏期和感染初期的病人，因此不能作为新冠肺炎确诊和排除的唯一依据。抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质（如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等）的存在而出现“假阳性”结果，所以抗体检测必须采用IgM和IgG同时检测且通常需多次动态检测来确认。

检测方法比较

  据报导，对SARS-CoV-2进行体外培养时，需96个小时左右才可在人呼吸道上皮细胞内发现，显然用于快速检测不现实。对于快速检测来说，当然是越快越好，能实现实时检测是最佳的（比如发烧可用红外测温仪实时监测）。不过，就目前的技术来说，最常用荧光PCR法核酸检测大约2-4小时；等温扩增法和结合CRISPR的等温扩增可以实现1小时以内的检测，但其真正临床样本的有效性还需进一步验证。抗原抗体法用试纸大约15分钟左右。抗原抗体法虽然方便、检测快，但目前不能作为确诊的唯一标准。

  步骤复杂，只有科学家会做的实验步骤绝不是好方法。目前最常用的检测方法，RT-PCR试剂盒产商也不断的对操作步骤简化，有些步骤也已有自动化仪器代替人工。操作步骤的简化不仅减少了检测时间，降低操作人员的操作失误和实验误差。就核酸检测法来说，文中提到的方法理论上都可实现全自动化，但目前平台的价格和一体化上还有很大的优化空间。

  灵敏度是检验要求中非常重要的指标。终极追求的是1个分子的病毒核酸能检测到，但不管哪种方法都几乎是不可能的。不过在科研条件下，上述4种方法都已经有报道达到分子级别的灵敏度（10分子以内），然而临床检测的要求更高，需要稳定的灵敏度。因此，考验生产厂商的不是技术本身，而是试剂的稳定性、合适的各试剂配比、引物序列设计的合理性、引物纯度、抗杂质干扰能力等等。目前国家药监局的分析灵敏度要求是300拷贝/毫升以下。

这包括所需环境价格（比如必须在专业实验室）、仪器价格，试剂耗材价格，人员培训费、人工操作费等。小编认为，这跟药物、疫苗的开发一样，商业利益和人道主义有共同的目标，但也有冲突的地方。商业利益追求更高的收益、更大的市场，所以说，他们看不上几块钱试纸条，而追求一台百万元级别的数字PCR和测序仪。从药物研究上也可看出，涉及老年慢性疾病研究和投入是最多的，而SARS的药物和疫苗研究几乎就没什么进展。如果说解决的办法，我想可能更多需要国家和公益机构投入更多资金（比尔盖茨和梅琳达基金会是很好的榜样）。

准确度和特异性是非常重要的检测指标，官方要求快速检测试剂盒准确度不低于99%，涵盖因变异导致的检测假阴性。简单地说，真感染病毒的人没检测出来，是假阴性；而没感染病毒的人测出病毒，是假阳性。造成假阴阳性的原因很多，例如，采样方法和质量、样品杂质、样品保存、试剂盒产品稳定性、人员操作失误等。如果单从技术方法来看，除昂贵的测序之外，目前第二代实时荧光定量PCR技术相对是最佳的。

新冠病毒检测的其他技术问题

    有报道称，现在官方核酸检测的阳性率仅有30-50%！大量的病人经过多次（有的多达6-7次）后，才被诊断为核酸阳性。这对尽早的收治病人，及时有效隔离和治疗很不利。也因此，2月12日开始，CT检测肺部异常的病人也被作为新冠病毒患者。那么，到底是什么原因，导致阳性率那么低？国家卫健委临检中心提出的4个关键点，基本可以解答：1）病毒量：被感染者的细胞中有一定量的病毒；2）采样：标本采集时要采集到含有病毒的细胞；3）试剂质量：可靠的体外诊断试剂4）人员：规范的临床实验室操作。

非技术层面的诊断问题

本人在内的不少同学都是生物学博士，也都基本会PCR技术，有同学都想自告奋勇为核酸检测出一份力。据了解，一方面其实不缺人手，大部分都放弃休假，上岗工作；另一方面，做PCR只是流程中的其中一步，作为检测新冠病毒的实验员需要严格培训，非专业操作人员想做并不那么简单。

北京协和医院发布新冠病毒的标准实验检测流程，我从视频中总结几个不同于常规PCR实验的关键点，1）得有专业的PCR分区实验室，缓冲区、试剂准备区、样本制备区、扩增分析区；2）规范的全身防护和消毒处理；3）在生物安全柜内，得非常注意样本处理，以防耗材仪器等被污染；4）严格防止样品核酸和核酸扩增产物污染环境造成检测假阳性；5）需2人以上配合完成整个实验操作。

    稀缺性：春节期间，激增的检测需求，使得试剂盒一度缺失。几十家原料生产商和试剂盒制造商紧急复工，逐步得到了缓和。在前天（2月20日），深圳华大基因和猛犸公益基金会向日本捐赠病毒核酸检测试剂盒。

    质量：截止目前，宣称可以检测冠状病毒的企业据不完全统计，至少有300家以上。实验室阶段的测试成功到真正能被临床应用，要跨过一道鸿沟，目前仅有其中的7家通过审批。即便那么高的门槛，仍有很多医生提出现有的试剂盒质量有问题，对于真正的病人也仅有30-50%的阳性率（当然低阳性率还有其他因素）。

    1月底，核酸检测出现严重供不应求的情况，被测到的人就如同“中奖”。小编的武汉同学一家也不例外，家里感染的四口人十多天的时间才陆陆续续做了核酸检测，好在他们都恢复了，为他们庆幸。

    1月16日以前，所有样本需要送到北京指定机构检测；1月22日，武汉批准的检测医院和疾控中心，全部运行，仅可测2000份。但这与激增的待测病人来说，这个数目远远不够。春节过后，试剂耗材已经充足，而官方的检测人员忙到没时间休息。

    从每日经济新闻网了解到，2月1日，武汉的华大基因团队收到2000多样本，而检测能力只有1200份，但之后几天，华大迅速扩大到1万份的检测能力，但由于不可描述的原因，后面一段时间收到样本基本没超过2000份，八成运力闲置。不止华大，康圣达等第三方也没等来预想中的样本数。

    官方与第三方的对比可以看出，中国第三方无论在检测能力、体量、迅速响应能力上表现非常优秀，而在非科研的其他环节是落后的。

其他需要考虑的问题

未来检测趋势会怎样？

自动化：检验科的医生在做核酸检测时大部分是手工操作，而华大的“火眼实验室”装备的华大智造自动化样本制备系统采用一站式核酸提取，一名检验人员每小时可以提取近百个样本。而如果是穿着防护服，人工提取1个样本花2个小时左右，人员操作失误、感染风险都会增加。未来，目标是从样品进入仪器，直接出来检测报告将是极好的。

新一代技术：新一代技术可能是全新的原理技术，也可以是对现有技术的改进和整合。

便携监测：除了专业实验室的检测，其他场景的检测也重要。包括1）社区快速检测，2）居家检测。这些仪器和耗材的配套开发是发展方向之一。

如何看待层出不穷的新方法和新药？

最近时不时爆出看似令人欣喜的消息，比如在检测方法上，某某公司制造出5分钟检测的试纸，又比如某某神药可治愈新冠病毒。我们对这些新闻该如何看待呢?

小编告诉你，即使是官方报道，也别点开，因为消耗精气神，要么是假的，要么看了也没啥用。

对于5分钟出结果的这种报导，相信你看了本文之后，也不会大惊小怪，因为毫无疑问，它是基于抗原抗体检测的方式，检测的场景有限。少数情况下，你发现，报道测的是核酸检测，那么有3种可能，1）造假，2）用了大量的模板，不可能达到临床检验试剂的要求，3）一个诺贝尔奖即将诞生。

如果是新药和新疫苗出现了好消息，多数情况说的确实是真的，双黄连实验也是真的。但是呢，那些好消息都是研究的起步阶段，离真正用到人体快的可能6-18个月（加速审批或许有可能，但有风险），慢的十年，当然了，绝大大多数会在临床1-4期实验中以失败告终。

管理问题？

在疫情的前期，中国科研界的迅速反应和水平是值得称赞的。但在前期的管控上颇有争议。不管如何，从管理上，疾控的管理和发布是不是应由专业人士直接发布和管控；网红张文宏高度同意新冠病毒流行控制常态化的理念。我的导师赵国屏院士在接受《中国科技报》采访时表示，需建立和完善包括疾控部门、医疗部门以及社区公安之间数据信息合作体系。

未来疫情发展方向？

    中国工程院副院长王辰在2月20日表示，有可能转变成慢性的、像流感一样的长期慢性病，这一说法其实早在1月31日Nature上提出过。玩过《瘟疫公司》游戏的就会熟悉，新冠病毒很多特性是“开挂”的，流言与消息封锁、交通要塞（武汉九省通衢，感染源华南海鲜市场就在汉口火车站附近）、人员流动（春运，流出500万人口），传染方式多样（飞沫传播、接触传播，现在水源和无敌特性气溶胶也有传播可能），轻症和无症状感染者也可能成为传染源（钻石公主号邮轮的统计来看，近一半是无症状者），这些提升了防控的难度等级…

    不管未来新冠病毒的发展趋势如何，长期有效的防控和各方面配套体系的建立是必须的。而作为普通人，好好工作，好好生活，保持critical thinking就很好。

为啥官方消息大多是正能量？

    这当然是搞社会正能量气氛了。至于优缺点，这里不做评论。

    不过据了解，一般策略是这样的：1）肯定网民期待，2）追责责任人，3）封堵，4）减少负面情绪，5）恢复秩序，6）发布利好，7）保持定力。

相信如果你认真看了此文，并且还看到这里了，那我相信你是拥有critical thinking的人，不会受媒体主观观点的左右。顺便推荐几个个人觉得还不错的公众号：《财新网》、《知识分子》、《中国新闻周刊》、《Tolobio》。

注：

1.本文仅代表个人观点。

2.有错误或任何想法欢迎留言指出。

参考资料