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吐露科技生态
2020/03/10

最新综述:CRISPR 技术在生物传感中的应用——胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA 记录

最新综述:CRISPR 技术在生物传感中的应用——胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA 记录

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图片由maple绘制

小编

本文发表自最新一期的《生物产业技术》杂志上。关于什么是生物传感技术?百度上只查到了生物传感器的定义:生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。而这里,大大拓宽了这一概念。我是这样认为的:以检测某种生物相关信息的信号为目的(可以是检测特定的DNA或RNA序列信息,可以是DNA在细胞内的空间位置信息,也可以是细胞代际关系、影响细胞状态的物质等),将这种较难检测的信号转化为另一种较易检测的信号,就是生物传感。当然了,之前生物传感器的定义中,关键一步用的是物理原理的信号转换,而这篇文章所讲的转换关键一步是生物原理。


摘要:核酸分子是生命的遗传物质和生命信息载体。如何观察细胞内特定核酸序列,快速检测核酸序列和记录检测的细胞活动过程?这些在分子生物学领域重要的科学问题需要强有力的技术来解决。如今,在基因组编辑领域赫赫有名的CRISPR技术开始涉足上述领域。在综述中,重点介绍CRISPR相关蛋白在生物传感方面的应用,包括细胞内特定基因组序列和RNA的成像、体外核酸快速检测以及细胞内DNA记录。核酸成像与核酸检测是将特定核酸序列的信息,通过CRISPR蛋白的参与转化为易检测的信号(如荧光);而DNA记录则是将细胞的代际或所接触的信号转化为细胞内DNA序列进行储存。这些新兴研究方向的开发和发展将大大促进CRISPR技术在基础科学、合成生物学、分子诊断等领域的应用。



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王金,上海师范大学副研究员,硕士生导师。主要研究方向是CRISPR 介导的DNA 编辑和核酸检测;开发了新型DNA 体外无缝拼接/编辑技术;提出了基于CRISPR/Cas12a 的新型生物元器件拼接标准;开发了基于CRISPR 的微生物基因编辑/ 基因调控技术、基于CRISPR/Cas12a 的核酸检测体系,并有望建成一套准确、灵敏、低价、快速的核酸诊断体系。任中国生物工程学会合成生物学专业委员会委员。


CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)系统是原核生物的获得性免疫系统,用于抵御外源入侵的病毒或质粒。2012 年,来自Ⅱ型CRISPR系统的CRISPR相关蛋白Cas9被证明可以在体外由简单设计的向导RNA(single guide RNA,sgRNA)引导识别并切割含PAM(protospacer adjacent motif)序列的靶标双链DNA ;很快Cas9又被成功应用于哺乳动物细胞的基因组编辑。从那时起,CRISPR技术在基因组编辑领域受到了高度重视和广泛应用,也连续多年被Science杂志列为“年度十大技术突破”。此外,CRISPR技术也被用于基因表达调控、高通量筛选、表观遗传学工程等领域。


本文将集中讨论CRISPR相关技术在生物传感中的应用, 具体包括胞内核酸成像(nucleic acid imaging in cells)、体外核酸检测(nucleic acid detection) 与胞内DNA记录(DNA recording)。胞内核酸成像是指在荧光显微镜下,观察到特定核酸序列在细胞内的空间位置,包括基因组成像和RNA定位。定位特定的核酸序列之前,主要通过原位杂交等技术对固定化细胞进行核酸定位;但该方法无法观察活细胞内的情况。在CRISPR技术诞生后,利用核酸酶失活的Cas9(dCas9,dead Cas9)蛋白融合荧光蛋白来研究活细胞内核酸的动态过程逐渐成为主流。核酸检测则是将特定核酸序列的信号放大并转化成易读取信号(如荧光)的技术。虽然传统的核酸检测技术已经很成熟,包括荧光定量PCR和核酸测序技术等,但是这些技术很难做到兼具高灵敏、特异、廉价、快速、操作简便等优点。在科学家发现Cas蛋白(特别是Cas12和Cas13)具备“附带切割” 效应并将其发展成为新的核酸快速检测工具之后,核酸检测领域便开始进入下一代技术的快速发展期。DNA记录是将细胞的遭遇(代际或外部刺激等)用改变细胞内基因组DNA序列的形式记录下来,再通过测序进行分析并还原细胞过程;这一技术为细胞或细胞群体时空状态的分析提供了强大的工具。


综合来看,基于CRISPR的新兴技术应用都是在CRISPR相关蛋白的参与下进行信息转化,将特定核酸序列信息转化成易检测信号,或将细胞遭遇转化成DNA序列信息。本文讨论上述领域的最新研究成果,并对这些技术的未来发展趋势进行展望。


1 CRISPR 用于细胞内核酸成像


1.1 基因组DNA 成像


众多研究表明,基因组的三维组织结构在调节基因表达和控制细胞分化中起着非常重要的作用,而活细胞内的可视化操作是研究基因组结构、基因表达和细胞行为的重要途径。


在CRISPR技术被开发出来之前, 基于核酸碱基互补配对的标记技术,如原位杂交(in situ hybridization,ISH),被广泛用于基因组研究和遗传疾病的临床诊断;这类技术的原理是基于体外合成并化学标记的核酸探针与内源核酸序列互补配对。虽然原位杂交技术非常强大,但其通常只能用于固定后的样品处理且需变复性操作,因而无法应用于活细胞内核酸序列的检测。为了实现活细胞基因组成像的目的,需要使用两种类型的蛋白:一种是DNA结合蛋白,用来结合特定的DNA序列并且不需要使靶标DNA变性;另一种是荧光蛋白,以便于通过荧光显微镜来直接进行观察靶标DNA的位置。因而将DNA结合蛋白与荧光蛋白融合,便可以实现对特定序列的可视化操作。然而要实现对任意基因组DNA的序列进行可视化操作,只有在可编程DNA结合蛋白被研发成便捷的工具之后才变得更加容易。目前,可用的可编程DNA结合蛋白包括ZFP(zinc-fi nger protein),TALE(transcription activator-like eff ector)和Cas9。虽然有研究组已成功使用ZFP或TALE对活细胞的内源基因或重复序列进行了可视化成像操作,但是在CRISPR技术被发明之后,由于Cas蛋白结合靶标序列进行编程的简易性和高效性,通过将核酸酶失活的Cas蛋白(如dCas9)与荧光蛋白的融合进行活细胞成像逐渐成为主流[ 图1(a)]。


图1 CRISPR 相关蛋白在生物传感中的应用

(包括胞内核酸成像、体外核酸探测与胞内DNA 记录)


首篇CRISPR基因组成像的文章于2013年发表。为获得足够的信号来实现目标基因位点的可视化,需要将sgRNA靶向高度重复的序列或通过sgRNA阵列(single guide RNA array)产生一连串sgRNA来靶向某一段非重复的序列。通过这种方法,研究人员将dCas9与eGFP荧光蛋白融合,并成功研究了细胞有丝分裂过程中具有重复序列的端粒和MUC4基因位点的动态行为。在这之后,类似的dCas9-eGFP系统也被成功用于标记和跟踪活小鼠胚胎干细胞的小卫星和端粒重复序列。


为了能够招募大量荧光蛋白结合到非重复序列的单个靶位点以实现单个位点成像,研究人员研发了两种策略。一种是在dCas9上连接重复多肽支架SunTag用来招募多达24 个GFP蛋白;另一种策略是让sgRNA上串联多达16 个MS2结合基序,进而通过MS2结合基序来招募MS2与GFP的融合蛋白,实现单个sgRNA(低重复序列的区域)或4 个sgRNA(非重复区域)的基因组成像。最近,一种称为CRISPR-Sirius的新sgRNA的支架设计使用了同样的MS2基序,但在基序间引入了不同的连接序列,从而使得基因组成像的信号得到了进一步的提高(多达60 倍)。


另外,基因组多位点荧光成像也是当前研究的重点。通过用3种正交Cas9蛋白来分别融合3种荧光蛋白( 即Nm dCas9-GFP、Sp dCas9-RFP、St1 dCas9-BFP), 结合靶向端粒重复序列设计的sgRNA,研究人员成功确定了相同或不同染色体上的基因位点之间的核内距离。另外,也可以通过改造sgRNA来实现多位点成像,例如,将sgRNA连接不同的RNA适配体(如MS2或PP7 RNA适配体)来招募与不同荧光蛋白融合的适配体结合蛋白(如MS2或PP7 外壳蛋白)到特定的基因组位点。目前,通过设计6种正交的sgRNA支架来同时靶向6处染色体座位可实现最多6种颜色的荧光成像,这种技术也被称为CRISPRainbow。


1.2 细胞内RNA 成像


除了基因组DNA,检测和操纵细胞内RNA的成熟(包括选择性剪接、核输出、亚细胞定位等)也是基础研究和合成生物学领域的重要课题。早在2014年,研究人员就发现了Cas9可利用PAM呈递寡核苷酸(PAMmers)来识别和切割靶标RNA。2016 年,dCas9-GFP也被开发用于追踪活细胞内的mRNA[图1(b)] ;例如, 通过设计特异靶向ACTB,CCNA2和TFRC mRNA的sgRNA, 研究人员利用dCas9-GFP观察到了RNA颗粒中靶标RNA的积累, 这与RNA-FISH的结果高度一致。除此之外,由于Ⅵ型CRISPR相关蛋白Cas13(旧称C2c2)靶向和切割RNA靶标,因此其切割活性失活的dCas13也被成功应用于靶标RNA的追踪成像。


2 CRISPR 用于体外核酸检测


核酸检测是病原菌检测、疾病检测、用药指导等领域的重要技术。虽然,目前已经开发出了许多核酸检测的方法[35],但更快速、更廉价、更特异、更灵敏的技术仍然是不断追求的目标。CRISPR技术无疑提供了核酸检测领域的新的解决方案,特别是基于Cas13和Cas12的反式切割(trans cleavage)或称附带切割(collateral cleavage)的活性开发的检测技术被誉为“下一代分子快速诊断技术”。


2.1 基于Cas9 的检测系统


通过将Cas9的特异性切割特征和核酸扩增体系结合,可实现针对靶标核酸的检测,从而可实现SNP(single nucleotide polymorphism)的区分和病原体表型的分型。目前,有至少3种结合PCR扩增的检测方法被成功开发,分别为ctPCR(CRISPR-typing PCR)、CARP(Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR)和基于CRISPR/Cas9切割活性的PCR。上述方法都是在PCR扩增之前利用Cas9切割完全匹配的靶标序列,而不切割产生突变的靶标序列,从而影响PCR的扩增结果,进而区分诸如高危人乳头瘤病毒(HPV)亚型HPV16和HPV18或是用来检测低频突变。


对于偏远地区的野外检测,常常需要无需精确循环控温仪器的等温扩增方法。结合NASBA(nucleic acid sequence based amplifi cation)介导靶标序列扩增,将Cas9、T7转录系统与基于纸质载体的等温toehold生物传感系统相结合,可实现通过肉眼观察来检测寨卡病毒的基因分型 [ 图1(c)]。此外,CAS-EXPAR(CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction)和CRISDA(CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplifi cation method)方法,都使用了Cas9的切割与等温扩增相结合的策略,以达到针对靶标序列的单碱基分辨率。


2.2 基于dCas9 的检测系统


将一个活性蛋白分裂成两个功能结构域,然后分别与一对dCas9蛋白融合;只有当一对dCas9同时靶向到临近的DNA序列上时,这两个分离的功能结构域才能组合到一起并重新形成一个有功能的蛋白来发挥作用。例如,PC(paired dCas9)DNA检测系统是用一对dCas9蛋白分别融合荧光素酶的两个分离结构域,并通过两个靶向相邻序列的gRNA来检测结核分枝杆菌DNA,显示出了高灵敏度与特异性[ 图1(d)]。PC系统的工作原理是,只有当靶标DNA存在时,这对dCas9才能结合到相邻的靶标序列,并帮助重新组合形成有活性的荧光素酶,产生可检测的信号。另一种基于dCas9检测系统名为RCH(RCA-CRISPR-split-HRP),即通过RCA(rolling circle amplification)扩增之后,用一对dCas9分别融合辣根过氧化物酶的两个结构域,然后通过显色反应来检测靶标DNA的信号。此方法有较高的特异性,可区分miRNA的单碱基差异。


2.3 基于反式切割活性的核酸检测


2.3.1 基于单链RNA反式切割活性的核酸检测系统


Cas13a 是RNA引导的RNA切割酶,属于Ⅵ型CRISPR-Cas 蛋白。在gRNA的引导下,Cas13a 结合单链靶标RNA后,除了能将靶标RNA切断之外,还可激发Cas13a的“反式切割”活性,即Cas13a随机切割体系中其他的单链RNA分子。基于Cas13a的该原理,研究人员开发了SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)的检测系统。具体做法是利用RPA(recombinase polymerase amplification)或者RT-RPA等温扩增系统将目标模板扩增为包含T7启动子的DNA模板,然后再利用T7转录系统把DNA模板转变为Cas13a可以直接结合的RNA靶标;同时在体系中添加一端为荧光发光基团、一端为荧光淬灭基团的单链RNA报告分子;在Cas13a结合靶标RNA后即触发Cas13a随机切割单链RNA探针的活性,从而产生游离的荧光发光基团并发出可检测的荧光[ 图1(e)]。利用该方法,研究人员灵敏地检测了各种DNA或RNA靶标,包括寨卡病毒、 登革热病毒、细菌分离株、抗性基因、人类DNA 基因型和癌症突变等。之后不久, 第二代SHERLOCKv2 系统被成功开发,其使用4 种正交的CRISPR-Cas 蛋白来实现多重靶标的检测。在此基础上,为了适应野外偏远地区的快速分子检测,研究人员进一步开发了HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)方法来直接对人的体液进行快速样本处理,然后利用SHERLOCK 方法便在不到2h 内直接从患者样本中成功检测出了登革热病毒。


2.3.2 基于单链DNA反式切割活性的核酸检测系统


除Cas13蛋白外, 来自Ⅴ 型的CRISPR-Cas12a蛋白也被发现具有反式切割特性;但与Cas13不同,Cas12a靶向DNA模板并反式切割单链DNA(singlestranded DNA,ssDNA)利用Cas12a蛋白建立的核酸快速检测方法的首次报导来自一篇2017 年提交的中国专利;后来,同一研究组在线发表了两篇研究论文,详细描述了Cas12a的切割特征和基于Cas12a的核酸检测方法,称为HOLMES(onehour low-cost multipurpose highly efficient system)[ 图1(f)]。同一时期,美国一个研究组也发布了基于Cas12a的、类似的核酸检测方法,名为DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter)。无论是HOLMES还是DETECTR都展示了非常高效、灵敏和特异的检测活性,可以用来快速检测DNA病毒、RNA病毒和人的SNP。


此外,研究人员还证明了嗜热的Cas12b 同样具有反式切割活性,并成功地将其应用于核酸检测, 并命名为HOLMESv2。由于Cas12b 具有广泛的切割活性温度,该酶可以和LAMP(loop mediated isothermal amplification)等温扩增系统结合,从而能够实现一锅式核酸快速定性和定量检测。此外,由于用于LAMP扩增体系的Bst 3.0酶可利用DNA或RNA模板直接进行扩增,基于Bst 3.0 酶的HOLMESv2 可极大地简化RNA的检测程序,并在无需对RNA模板先行逆转录操作的情况下,成功实现在1h 内快速检测RNA病毒的目标。


最近,新鉴定的CRISPR-Cas14蛋白被发现同样具有反式切割能力,并可以应用于核酸检测。不过,由于Cas14仅能靶向ssDNA,在检测系统中需要先将扩增后的双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)模板中的其中一条链降解以生成ssDNA模板[53],因而也为整个操作过程带来了不便。


3 CRISPR 用于DNA 记录


基因组DNA由于其易获得、保存时间久、生物功能兼容等优点,被普遍认为是未来人工生物信息存储的理想介质。随着基因组编辑技术的不断发展,人们可以高效动态地改变遗传信息,并将信息储存于活细胞中以实现体内DNA记录。该技术也为合成生物学开辟了一条新的途径。


3.1 基于Cas9 的DNA 记录系统


由于非同源末端连接(nonhomologous endjoining,NHEJ)修复断裂的DNA时会产生突变,因此可以利用Cas9产生靶向dsDNA的断裂,然后结合NHEJ在每个单独细胞的靶基因位点获得伪随机突变特征(即插入缺失突变)。在这些系统中,Cas9被靶向到由多个相同序列(阵列)组成的靶标位置,然后这些靶点在细胞连续记录过程中被随机且不可逆转地改变,因此可以用于动物的大规模记录和谱系重建[ 图1(g)]。Cas9也可靶向sgRNA自身,即stgRNA(self-targeting RNA),随着时间的推移,用来转录stgRNA的DNA序列将经历连续突变,因而可以用于哺乳动物细胞异种移植模型中炎症水平的记录。


除了可以通过Cas9切割和NHEJ修复来记录之外,还可以通过利用dCas9融合单碱基编辑器来实现DNA编写和信息记录的目的。


3.2 基于Cas1-Cas2 的DNA 记录系统


另一类DNA写入系统是基于Cas1和Cas2蛋白构建的,它们介导CRISPR细胞免疫系统中间隔序列(spacer)的获取。该系统中的Cas1-Cas2复合物可以对细胞内各种来源(自身或外源)的ssDNA序列进行采集,然后将短链ssDNA片段(20 ~ 30 个碱基对)整合到预先存在的CRISPR阵列中,并随着时间的推移不断扩展CRISPR阵列[ 图1(h)]。同时,该系统也能够记录随时间变化的生物信号,被称为CRISPR生物卡带(biological tape)。类似的间隔序列捕获技术也可被应用于信息存储,例如研究人员将一部数字小电影信息转化为DNA序列信息,并将这些人工合成的DNA序列信息以间隔序列捕获的方式成功地储存到细菌的CRISPR陈列中。最近,有研究报导在大肠杆菌中可通过FsRT-Cas1-Cas2系统直接获取RNA序列,并用于定量记录外界刺激(如RNA病毒侵染或氧化应激等)。


4 总结与展望


短短几年时间,CRISPR技术已经从基因组编辑领域的应用逐步演变为多用途的强大的生物学工具箱。本文重点论述了CRISPR相关技术在胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA记录方面的最新研究进展,并从不同角度介绍了CRISPR相关蛋白的特性;三个方向的应用都涉及核酸序列和信号之间的转换,其中,前两者是将核酸序列转换为可检测的信号,而后者则是将各种应激信号转换为核酸序列。


相比于传统的方法,CRISPR技术在细胞内核酸成像的优势在于其可用荧光的方法实时监测细胞内特定基因组序列或特定RNA的动态过程,从而帮助进一步深入了解生命过程。近几年,研究人员在提高信噪比、更多靶点实时动态监测等方面做出了诸多努力。虽然CRISPR成像已经显示出其强大的威力和发展潜能,但该方法的潜在问题也需要进一步探讨。比如,转化含Cas基因的质粒、Cas的编码RNA或向导RNA或Cas蛋白是否会改变细胞本身的状态,进而干扰细胞的发育过程。


基于CRISPR的核酸检测方法被誉为“ 下一代分子诊断”系统,具有速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便、价格便宜等优势。因此,SHERLOCK和HOLMES等快速检测方法建立后就受到了分子诊断领域的关注,并被给予重大的期望。然而现有CRISPR检测技术仍然依赖于对靶标核酸进行扩增和富集以获得足够的检测信号;因此,为实现更好的检测灵敏度和建立更简单的检测体系(如不依赖于靶标核酸富集),新Cas蛋白的挖掘和新方法的建立仍然是必要的和值得期待的。此外,CRISPR诊断技术要想和现有分子诊断技术(如荧光定量PCR或NGS高通量测试等)在商业市场上展开竞争,必须尽快开发基于CRISPR诊断技术的检测设备、样本处理体系和大量的检测试剂盒,并在效率和成本上展现其优势。


DNA记录技术是将基因组DNA作为一种动态的存储介质,以便在活细胞中记录和存储应激信息。自诞生以来,该技术已经取得了巨大的进步并展现了无限的发展潜力,但是在记录架构的改进方面仍然存在很大的进步空间,特别是在记录容量、稳定性、适应性、细胞资源消耗、编写效率和分辨率等方面,这些技术的进步将会显著提高以动态和多线路的方式来记录和存储DNA信息的能力。


虽然这些生物传感技术才发展短短几年,但是相信这些技术不久就会得到更加广泛的应用和发展,尤其是在基础科学研究、合成生物学、医疗和工业等领域。



全文刊登于《生物产业技术》2019年第1期

转载自生物产业技术公众号


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