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最新综述:RNA开关

2019-02-15
最新综述:RNA开关
摘要:除了编码蛋白质序列外,RNA分子还编码多种基因调控元件。RNA开关是一类基因调控元件,依赖于特定配体分子浓度的方式调控蛋白质表达。这些变构基因调控元件被证明是工程化改造多种细胞的有用工具。特别是,RNA开关已被用作遗传编码的生物传感器和条件控制器,以根据系统的变化环境来指导细胞决策。该领域的一个重点是生成新型RNA开关,这些开关是针对不同的生物系统而定制的。这里回顾了用于生成RNA开关的方法,这些RNA开关具有独特的物理特性和基因表达的调控方式。

本文进行精简编译

原文:Schmidt C M, Smolke C D. RNA Switches for Synthetic Biology[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2019, 11(1): a032532.


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图片由maple绘制

本文作者

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Calvin Schmidt是斯坦福大学生物工程系Christina Smolke教授实验室博士研究生,开发自动化生物系统设计的机器学习技术。此外,他还协助早期投资者采购和评估生命科学初创公司,重点是合成生物学。


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Christina Smolke博士是斯坦福大学生物工程副教授(Associate Professor),她领导合成生物学、酵母代谢工程和生物分子工程领域的世界领先研究项目。她开创了酵母生物合成平台的开发,用于一类重要的植物天然产品-苄基异喹啉生物碱。她的创新和研究获得了众多奖项,包括NIH主任先锋奖,WTN生物技术奖和TR35奖。


天然的核糖开关可以作为设计工程化RNA开关的起点

核糖开关(Riboswitch)首先在天然系统中被发现。这些天然存在的RNA开关通常针对常见的代谢产物,通过提供正或负反馈调节机制来改变遗传活性,并在维持体内平衡方面发挥重要作用。通常,核糖开关通过与靶代谢物的结合,偶联二级结构构象变化,这反过来改变了开关内编码的基因表达活性。然而,在这个简单的框架内,天然开关有多种方式将二级结构构象的变化与基因表达的变化联系起来。已经发现天然核糖开关改变二级结构的稳定性以改变各种基因表达过程的速率,包括转录终止,翻译起始和转录物降解。

天然存在的RNA开关可以作为产生非天然反应功能的起点。最重要的是,某些RNA开关已经从它们自然而然地直接在不同的细胞环境中使用。例如,来自蜡状芽孢杆菌的c-di-GMP开关用于控制枯草芽孢杆菌中靶基因的表达。在另一个实例中,显示来自枯草芽孢杆菌的葡糖胺6-磷酸开关在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中起作用。在两个例子中,都不需要修改RNA开关;这些开关分别简单地插入了感兴趣的基因的5'和3'非翻译区域,并且在新的细胞结构中显示了功能。这些实施例还显示了使用基于RNA的开关而不是基于蛋白质的开关的优点。RNA开关通常不依赖于其他蛋白质的活性,并且在转录物作为基因靶标的情况下编码,这可以减少脱靶效应。通过这种方式,RNA开关可以在不同的生物体中更可靠地运行基于蛋白质的切换。

在许多例子中,可以通过改变序列来开关在新的细胞环境中的功能活性。天然存在的RNA开关的众多实例说明了RNA可用于调节基因表达以响应目标化合物浓度的许多方式。天然存在的RNA开关的作用机制已被用于为工程RNA开关的合理设计提供设计选择。


RNA开关可以使用基于规则方法进行理性设计

RNA开关的功能活动通常主要取决于它们的二级结构。RNA序列的可能的二级结构构象和相关的能量学可以使用多个二级结构预测程序预测。因此,这些预测程序可以用于从头开始设计新的RNA开关,采用可能影响其基因调控活性的构象。能够从头开始设计新的开关,或重新设计已知的开关以改变某些特性,这是RNA开关相对于基于蛋白质开关的另一个优势。

尽管通过基于规则的方法构建了许多开关的例子,但合理的设计过程并不总能产生功能开关。涉及配体结合,核酸构象转换和基因表达调节的复杂动力学和热力学通常意味着合理设计的RNA开关的功能活性可以变化很大。因此,在获得具有期望活性水平的开关之前,通常需要多轮迭代设计和调整。

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. 显示理论上合理设计的RNA开关构象的不同组分图表。(A)配体结合和非配体结合构象的示例。(B)核糖体可结合和不可结合构象的核糖体结合位点(RBS)。(C)组装的RNA开关,其中连接序列使配体结合能够稳定允许核糖体结合的RBS构象。


计算工具可以实现更高效的RNA开关设计

由经验规则引导的RNA开关的合理设计可能是耗时的过程。很少可能的序列会具有所需功能的开关活性,需要迭代许多设计周期,包括计算折叠并最终通过实验验证每个设计。结合自动化-使用计算机程序模拟RNA序列的折叠,分析预测的结构,并选择确定设计标准的顺序可以加速这一过程。例如,开发了用于设计配体敏感性终止子的计算程序,使用某些设计规则。比如,程序通过搜索序列将茶碱配体连接到具有随机化接头序列的转录终止序列,选择遵循特定规则的序列。该程序还纳入其他因素,以便进一步选择能够提供所需活性的序列。一个自动化的过程能够迭代更多的序列,使得人类更加理解,因此更有可能识别满足所有标准的序列。最终,这些程序搜寻了数千个序列,并开发了茶碱和四环素开关。

自动化合理设计过程的程序使得RNA开关的设计对于那些在该领域没有专业知识的研究人员来说也可参与进来,并且减少了为具有功能性RNA设计专业知识的研究人员设计开关所需的时间。这些工具可以通过执行潜在开关序列的迭代和计算机评估来帮助合理设计RNA开关,以快速生成用于实验验证的候选开关。但是,这些工具生产的设计无法保证显示出所需的功能活动。虽然这些工具可以加速和简化前端设计过程,但是生成的候选设计通常是由专家借助RNA折叠程序生成的。

为了提高基于RNA二级结构预测软件的计算设计程序的准确性,已经开发了包含生物物理模型的计算程序。生物物理模型用于通过考虑RNA折叠、配体结合、转录和翻译的热力学和动力学将RNA开关的结构状态与基因表达水平联系起来,以得出关于特定RNA的功能活性的预测。

通过计算预测RNA序列的物理状态如何与目标生物系统中的不同过程相互作用,使得设计过程更加可靠和稳健。


高通量筛选RNA开关库

产生RNA开关的第三种方法利用增加容量来生成和筛选数千种特定于设备的设计以找到最佳设计。RNA转换文库可以通过随机诱变或通过随机化特定核苷酸的文库的排序以更合理的方式产生。通常,RNA开关文库设计有恒定的传感器和执行器序列,并且连接这两个结构域的区域被随机化以搜索那些允许分子靶标与传感器结构域结合以影响基因表达活性接头的序列设计。然后使用高通量实验技术筛选以这种方式设计的文库以分离最佳序列。筛选通常采取两个交替阶段的形式:在靶配体存在下“阴性”筛选和“阳性”筛选,分别是不存在靶配体下筛选,以及在特定配体条件下显示所需活性的序列被选中进入下一阶段的筛选。

用于筛选的体外方法已经用于产生最终用于体内应用的RNA开关。这些方法提供了优于体内筛选方法的优点,因为它们能够筛选更多数量的序列。可以用非常大量的独特序列产生RNA文库;然而,与转化效率和测量技术相关的瓶颈基本上限制了可以在体内筛选的序列的数量。体外筛选的主要缺点是,由于两种环境之间的差异(例如,离子浓度,转录率),体外系统中实施的序列起到体外转换的作用可能不能保留该功能,这可能影响RNA的折叠方式和最终的结构。建立体外筛选以鉴定RNA分子,是在配体存在和不存在下如何改变通知或起作用,其可导致体内环境下基因表达的变化。


结论

RNA为配体基因调控元件的设计提供了灵活的平台。研究人员已经开发出了一种广泛的解决方案,从计算机从头设计到高通量筛选序列库,可根据感兴趣的应用量身定制的RNA开关。尽管在工程化改造功能RNA领域取得了重大进展,但RNA开关的设计仍存在关键挑战,定量活性并对特定配体有响应。我们对RNA生物学的理解的进展,包括RNA二级三级结构的预测共转录折叠折叠动力学和能量学,都是提高设计策略准确性的关键。进一步研究将使用高通量、大规模并行筛选生成的大量序列活性数据集的计算分析,以最终生成新的设计规则。此外,人们可以通过将从头配体生成和开关生成结合到单个整合选择过程中来,进一步简化开发能够检测新配体的RNA开关的过程。RNA开关的示例在不同的生物系统中越来越多地实施,扩展的能力用于生成针对预期应用定制的开关对其成功翻译至关重要。