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新书:微生物代谢工程——方法和操作规程

2019-03-15
新书:微生物代谢工程——方法和操作规程


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图片由maple绘制


摘要:这本书涵盖了广泛的主题,有助于研究人员工程改造复杂的生物系统。本书共分为三部分:第一部分论述了工程相关生物合成途径的发现与识别;第二部分着眼于操纵酶、生物合成途径和整个基因组的遗传工具的发展;第三部分介绍了利用靶向和全局系统生物学工具在计算机模型中对工程微生物的描述。探讨的主题,如利用酶建立新的生物合成途径;快速菌株优化组合多基因途径的构建,应用组学技术来识别瓶颈;改造非传统的寄主生物,如蓝细菌和脂质体。包括介绍必要的材料和试剂的列表,容易复制的实验室操作,故障排除和避免已知陷阱的提示。

原书https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-9142-6

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01
天然宿主和生物的途径和基因发现

Pathway and Gene Discovery from Natural Hosts and Organisms

Jing Ke, Yasuo Yoshikuni

关于微生物和植物的基因组和宏基因组的公共序列数据库中的信息迅速增长。结合生物合成基因簇、分子生物学、合成生物学和分析工具的计算鉴定技术发展,揭示了具有最佳和靶向功能的酶的基因,以及丰富的无特征代谢途径。本章讨论了发现自然界中微生物和植物中基因和代谢途径的不同方法,如基因组挖掘,转录组分析和代谢物分析


02
计算机代谢网络扩展的预测和开发酶的多功能性

Metabolic In Silico Network Expansions to Predict and Exploit Enzyme Promiscuity

James Jeffryes, Jonathan Strutz, Chris Henry, Keith E. J. Tyo

越来越多的人认为酶不仅能催化一个典型的反应,而且能催化一系列相关反应。在酶的天然环境中,这些能力常常被忽视,但当酶暴露在新的底物或高浓度的途径中间体中时,这些能力在工程代谢中就会变得明显。这一章描述了如何在计算机网络扩展(MINE)数据库中使用代谢来预测新的生物转化及其产生的代谢产物。特别是,通过结构相似性或代谢组学数据搜索使科学家能够检测、利用。

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03
用于下调表达的反义RNA元件

Antisense RNA Elements for Downregulating Expression

Yaping Yang, Jian Wang, Ruihua Zhang, Yajun Yan

反义RNA (asRNA)技术是下调基因表达的重要手段。当应用这种策略时,asRNA的干扰效率由支架设计、环路大小和相对丰度等因素决定。本文以大肠杆菌编码malonyl-CoA-[酰基载体蛋白]transacylase的fabD基因为例,以可靠可控的干扰效率来描述asRNA的设计。采用实时PCR法和荧光法分别检测RNA水平和蛋白水平的干扰效率。

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04
用于多重代谢途径工程的化学诱导染色体进化(CIChE)

Chemically Inducible Chromosomal Evolution (CIChE) for Multicopy Metabolic Pathway Engineering

Aaron M. Love, Bradley W. Biggs, Keith E. J. Tyo, Parayil Kumaran Ajikumar

化学诱导染色体进化(CIChE)是一种用于稳定的多拷贝染色体整合外源基因的技术。在这项技术中,在抗生素选择标记和同源区域相同的感兴趣基因的两侧,通过recA介导的同源重组实现基因复制。基因复制一个强大的选择压力可以通过增加应用抗生素浓度,并在一个星期的时间可以创建一组菌株产生广泛的复制(20以上),这可以删除recA来维持稳定。在这里,我们描述了该方法的一个通用工作流。


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05
膜相关细胞色素P450的细菌表达及其在纳米盘中的活性测定

Bacterial Expression of Membrane-Associated Cytochrome P450s and Their Activity Assay in Nanodiscs

Demetrios Maroutsos, Hannah Huff, Aditi Das

真核细胞膜结合的细胞色素P450s在细菌系统中表达,产生大量的催化活性蛋白用于结构功能研究。近年来,真核细胞膜结合的CYPs在细菌中表达的实例有很多,这些CYPs是通过对蛋白的N端膜结合域和与底物结合有关的非连续的F-G膜结合环进行各种修饰后表达的。这些修饰已被证明不会干扰感兴趣的蛋白质的功能。在细菌中表达膜结合细胞色素P450s的关键因素有:(a)外显子优化(b)选择合适的载体和寄主菌株,(c)与摇瓶温度和速度有关的生长和表达条件。在此,我们描述了表达和纯化真核细胞膜结合细胞色素P450s的方法。我们还以细胞色素P450 2J2和CYP725A4为例,以紫杉醇合成第一步中表达的细胞色素P450为例,描述了细胞色素P450活性的测定。此外,我们还讨论了为了表达膜结合细胞色素P450s而进行的不同修饰的优缺点。


06
酿酒酵母中Delta 整合 CRISPR-Cas(Di-CRISPR)的应用

Delta Integration CRISPR-Cas (Di-CRISPR) in Saccharomyces cerevisiae

Shuobo Shi, Youyun Liang, Ee Lui Ang, Huimin Zhao

尽管酿酒酵母的基因工程取得了进展,但大型生物化学途径的多拷贝基因组整合仍然是一个挑战。在这里,我们开发了一个Di-CRISPR (delta integration CRISPR-Cas)平台,该平台通过定期聚集间隔较短的回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关系统(Cas)来切割delta位点,从而使酿酒酵母基因组中前所未有地高效、多拷贝、无标记地整合大型生化通路。在整个流程中提供了详细的操作流程,包括pDi-CRISPR质粒和供体DNA构建、di - crispr介导的整合以及通过流式细胞术和定量聚合酶链反应(qPCR)分析整合效率和拷贝数。

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07
使用IIs型限制酶组装复杂途径

Assembly of Complex Pathways Using Type IIs Restriction Enzymes

Sylvestre Marillonnet, Stefan Werner

高效的DNA组装方法是合成生物学和代谢工程的重要工具。在最近开发的几种可一步组装多个DNA片段的方法中,使用IIS型酶进行DNA组装为复杂的通路工程提供了许多优势。特别是,它为用户提供了使用一系列简单的单组装步骤快速组装多基因结构的能力,这些步骤从克隆和测序部件的库开始。我们在此描述一个使用模块化克隆系统(MoClo)组装多基因结构的方法。使用MoClo系统进行构建首先需要定义最终构建的结构,以确定构建策略所需的所有基本部分和方向。然后用一系列一锅组装步骤组装多基因构建物。


08
将单链组装与Golden Gate组装相结合,实现多基因途径的组合组装

Combinatorial Assembly of Multigene Pathways by Combining Single-Strand Assembly with Golden Gate Assembly

D. Bauwens, P. Coussement, J. Maertens, Marjan De Mey

精细化工和原料药生物技术生产路线逐步探索和开发。然而,这一发展受到许多限制因素的阻碍,如最佳表达水平、代谢压力、反馈调节等。

在此基础上,我们提出了一种新颖、可靠、快速的单链组装方法。在此基础上,提出了一种基于单链组装和golden gate的多基因组合组装方案,充分利用了这两种组装技术的优点。

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09
使用Keio Collection进行表型测试的检查和平衡

Checks and Balances with Use of the Keio Collection for Phenotype Testing

Sandra J. Aedo, Helena R. Ma, Mark P. Brynildsen

Keio单基因敲除收集包括约4000个大肠杆菌K12菌株BW25113的突变体,其中每个突变体包含一个卡那霉素抗性,以取代单个非必需基因。这个突变体库已经被证明在细菌学、化学基因组学、生物技术和系统生物学领域非常有用。在该集合的各种应用中,最广泛的应用是评估特定基因功能的丧失如何影响表型。在这一章中,我们描述了使用可用于确保库中突变的鲁棒表型评估的集合和过程的缺陷。这些步骤包括通过PCR确认基因缺失,噬菌体将突变位点转导到新的宿主菌株,以及基因互补的策略。


010
蓝细菌基因工程:设计,实施和表征重组集胞藻PCC 6803

Genetic Engineering of Cyanobacteria: Design, Implementation, and Characterization of Recombinant Synechocystis sp. PCC 6803

Jacob Sebesta, Allison Werner, Christie Ann Marie Peebles

Synechocystis sp. PCC 6803是一种已被用于生产多种燃料和化学品的蓝细菌模式生物。基因突变是研究光合作用和工程化学生产的重要内容。本文详细介绍了Synechocystis sp. PCC 6803的培养、保存和基因转化方法,包括利用绿色荧光蛋白报告子检测启动子强度的方法。提出了一种染色体DNA无标记转化的方法。


011
用于解决解脂耶氏酵母的流程和加速途径工程的遗传工具

Genetic Tools for Streamlined and Accelerated Pathway Engineering in Yarrowia lipolytica

Lynn Wong, Benjamin Holdridge, Jake Engel, Peng Xu

解脂耶氏酵母是一种具有多种生理和代谢特性的工业产油酵母,具有广泛的生物技术应用前景。虽然解脂耶氏酵母在工业应用方面有着悠久的历史,但是能够有效且高效地对其进行工程的遗传工具的数量仍然远远落后于大肠杆菌和酿酒酵母等常见生物可用的大量工具。在这个方法中,我们已经开发了一个完整的和通用的基因工具箱,专为解脂耶氏酵母的易用性基因操作。我们创建了一个通用的DNA组装平台YaliBrick,它可以通过重复使用的遗传部分简化大型多基因通路的克隆。我们建立了一种敏感的荧光素酶报告基因分析方法,以表征12个内源启动子。此外,我们使用YaliBrick在多基因构建中生成不同的基因构型。抗癌、抗菌色素紫醋素的五基因生物合成通路在1周内快速组装完成,证明了将通路平衡策略与我们的YaliBrick载体整合的简单性和有效性。最后,我们将CRISPR-Cas9整合到YaliBrick载体中,实现了脂质体CAN1(精氨酸渗透酶)基因组位点的indel突变和移码基因缺失。报告的方案提供了一个在解脂耶氏酵母中标准的程序,精简和快速代谢途径工程。


012
气相色谱 - 质谱法微生物代谢组学在菌株优化中的应用

Gas Chromatography–Mass Spectrometry Microbial Metabolomics for Applications in Strain Optimization

McKenzie L. Smith, April M. Miguez, Mark P. Styczynski

代谢组学是生物系统中生化中间体的系统尺度测量;由于其对代谢的深入而广泛的研究,在代谢工程中具有很大的应用潜力。代谢工程师对代谢组学中广泛使用的许多分析技术进行事后分析产品效价是很熟悉的,但要在系统范围内准确地捕获代谢,而不仅仅是测量单个分泌的产品,则需要复杂得多。尽管如此,代谢组学(目前还没有像许多分子生物学服务那样,被广泛地作为一种可负担得起的消费者服务提供)已经进入了许多装备良好的代谢工程团队的掌握范围。为此,我们提出了一种详细的代谢组学操作,并将其应用于应变优化。具体地说,我们着重于利用气相色谱-质谱联用技术来表征酿酒酵母的代谢特性。


013
用于应变优化的基于靶向质谱的蛋白质组学工具

Targeted Mass Spectrometry-Based Proteomics Tools for Strain Optimization

Hsien-Chung Tseng, Christine Nicole S. Santos

菌株优化的目标是在高滴度、高产率和体积生产力的条件下,创造出能产生感兴趣的化合物的高效菌株。菌株优化的有效性依赖于用于帮助细胞内原生或新途径优化的方法。许多不同的因素,包括mRNA的丰度蛋白质的丰度酶的活性/稳定性,都会对菌株的性能产生影响,而仅仅通过监测产品滴度往往是不够的。为此,利用LC-MS-MS(液相色谱-串联质谱联用)的靶向蛋白质组学工具最近被开发出来,可以在很高的灵敏度下监测蛋白质水平。在这里,我们描述了开发用于菌株优化的蛋白质组学工具时的所有相关方面。


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014
基因组规模综合代谢和调控网络模型的构建和管理

A Protocol for the Construction and Curation of Genome-Scale Integrated Metabolic and Regulatory Network Models

Sriram Chandrasekaran

基因组规模的代谢网络模型在过去十年中得到了广泛的应用,并已被证明能够成功地预测许多生物的代谢行为。然而,代谢调节的复杂性往往限制了这些模型的准确性。最近开发了结合代谢和调控网络的整合建模方法,从而扩大了基因组规模建模的能力和准确性。本章为此类集成网络模型的重构和管理提供了指导。具体来说,本协议描述了PROM(代谢的概率调节)和GEMINI(用于网络推理的基因表达和代谢集成)方法。PROM是一种用于构建集成代谢和转录调控网络模型的自动化方法,而GEMINI方法则使用转录组学和表型学数据管理集成网络模型。GEMINI代表了第一次尝试应用现有的成熟的管理工具来管理代谢网络。这些方法生成的集成网络模型能够对各种生物数据进行机械集成,并能够识别设计细胞代谢的新策略。


015
细菌代谢的13C-指纹图谱和代谢流量分析

13C-Fingerprinting and Metabolic Flux Analysis of Bacterial Metabolisms

Whitney Hollinshead, Lian He, Yinjie J. Tang

在微生物宿主的中心代谢中,13C辅助代谢分析提供了细胞内反应速率的精确计算。这种微生物细胞内网络的映射被证明对理解细胞生理学是至关重要的。该方法也是识别中心代谢节点、探测代谢网络的刚性、揭示辅因子平衡和描绘隐藏路径的关键。在此,我们提出了使用稳定的同位素碳底物对细菌种类进行定性(13C功能通路指纹)和定量(代谢通量分析)代谢研究的方法。在这个方法中,我们包含了使用开源的WUflux软件进行基于氨基酸或自由代谢产物标记信息的稳态通量计算的分步说明。

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016
遗传筛选酵母类异戊二烯通路中通量增加的突变体的分离

A Genetic Screen for the Isolation of Mutants with Increased Flux in the Isoprenoid Pathway of Yeast

Manisha Wadhwa, Anand K. Bachhawat

酿酒酵母是代谢工程生产萜类化合物的首选宿主之一。目前还缺乏一种基因筛选方法来识别能够增加类异戊二烯途径通量的新突变体。我们在这里展示了一种方法,这种方法通过从红酵母红孢子虫(一种已知的类胡萝卜素含量很高的生物体)中提取类胡萝卜素基因,开发出一种基于类胡萝卜素的可视筛选。我们还讨论了用这种方法来鉴定突变体,可以获得更高的类异戊二烯通量。

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