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最新综述:为大规模生产设计鲁棒性微生物

2019-03-15
最新综述:为大规模生产设计鲁棒性微生物


摘要:系统生物学和合成生物学越来越多地用于研究和调节复杂的生物系统。因此,利用这些方法可以解决微生物生产过程中出现的许多问题。我们回顾了实验室规模培养和更大规模过程之间的差异,以便对那些在规模化过程中特别重要的菌株特性提供一个视角。系统生物学已被用来研究一系列微生物系统,以了解它们在生物反应器中对营养物质、溶解气体和其他压力波动的反应。合成生物学已被用来评估和调节菌株的反应,并设计菌株以提高产量。我们讨论了这些方法和工具的背景下,他们在工程强大的微生物应用于大规模生产。


原文:Wehrs M, Tanjore D, Eng T, et al. Engineering Robust Production Microbes for Large-Scale Cultivation[J]. Trends in microbiology, 2019.

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图片由maple绘制

要点

1.实验室中的工程改造通常不考虑大型生物反应器中的工艺要求。

2.系统和合成生物学可以应用于设计微生物菌株,使可靠和鲁棒的大规模生产。

3.商业微生物平台的选择和开发应基于最终工艺目标的相关性。


鲁棒性,Robust的音译,也有人翻译成强健的,但不同于稳定。

所谓“鲁棒性”,是指控制系统在一定(结构,大小)的参数摄动下,维持其它某些性能的特性。

所谓“稳定性”,是指控制系统在使它偏离平衡状态的扰动作用消失后,返回原来平衡状态的能力。


工业规模扩大过程中的挑战

众所周知,微生物可以产生大量的化合物,从燃料和商品化学品到药物和精细化学品。然而,尽管开发的微生物平台将几乎所有碳源转化为几乎任何想要的产品,但这些案例中微乎其微的案例成功地过渡到工业规模的过程和市场产品。具有既定化学或生物合成路线的经济竞争力是一个重要因素。在实验室,低滴度和低产量也需要克服。然而,在核心生物转化技术层面,一个主要原因是工业规模生物反应器下,预测菌株性能的挑战。商业规模的生物反应器的环境与实验室规模的培养环境(如摇瓶)截然不同。长期以来,人们已经认识到,大多数菌株在两种情况下的表现不尽相同。最近的一项评估显示,大规模生产一种化学品的成本在1亿美元到10亿美元之间。失败的风险和成本很高,微生物底盘本身的去风险应该是菌株工程的一个重要方面。


微生物生产系统工业规模化的工艺工程实践已经相当成熟。相比之下,微生物表型对波动的生物反应器条件的响应、长期培养过程中的基因型漂移等生理因素的研究较少,而这些因素对放大性能的潜在影响直到最近才重视。在这一领域,最好的方法是缩小模型,在这种模型中,大量的菌株在大规模生长和生产的条件下产生和测试,从而能够更好地选择可预测地扩大规模用菌株。然而,要开发出能够在大规模生产时保持所需生产特性的菌株仍然很困难。


系统和合成生物学的进步可能能够在这个领域提供解决方案。除了使用没有质粒或诱导剂的菌株等改进之外,还有一些雄心勃勃的问题有待提出。我们能否创造基因和表型稳定的菌株,以防止在种子培养过程中表型漂移?我们是否能够可靠地增加生产阶段的持续时间,以提高流程的盈利能力?我们能追踪亚种群和表型漂移与培养的因果参数吗?我们能否动态调控基因和途径,以响应抑制副产物和波动应力,减少负面选择和增强鲁棒菌株性能?有一些研究的例子单独处理了这些问题,如果把它们合在一起提出,就会显示出这种方法的全部潜力。


最雄心勃勃的是,我们设想了微生物工程方法,可以预测一个菌株如何生长商业规模生物反应器环境中的行为,将使我们能够预先设计压力满足这些需求(图1)。在评估中,我们关注系统和合成生物学方法,可以更好的理解在扩大生理变化,在工业条件下,合成生物学方法可以提供方法来控制这些反应。虽然这些方法尚未得到充分利用,但有一些很好的例子说明了这些方法在工程菌株预测设计中的潜力。

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在实验室规模的菌株改造中没有考虑放大参数

微孔板摇瓶,再到生物反应器,最终到商用生物反应器,在生物放大过程中,许多化学、物理和生物因素都会对微生物的生长和产品的形成产生负面影响。使这个问题更加复杂的是,在初始菌株工程阶段的高通量表型筛选中,模拟在这些不同的扩大阶段所遇到的环境并不简单。此外,在扩大规模过程中需要应对的相关挑战因宿主微生物和培养产品的不同而有所不同。


此外,在微滴定板和摇瓶中进行的许多测量与在生物反应器研究中进行的分析不同(图2)。这加剧了实验室规模的菌株优化不能解决或解决挑战的风险,而这些挑战随后将被视为生物过程朝着商业化的方向扩展。

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图2


物理和机械应力

实验室规模和大规模培养的一个显著区别是操作压力。随着生物反应器体积的增加,生物反应器中水柱的高度会产生越来越大的静水压力梯度。原则上,压力可以影响生物特性,包括对细胞活力和代谢通量重要的酶活性和细胞膜通透性。在商业规模的生物反应器底部增加的静水压力提高了溶解气体的浓度。例如,溶解的二氧化碳(dCO2)与碳酸氢盐和碳酸盐离子平衡造成介质渗透性,影响培养基pH值。因此,dCO2的生理效应可能是由于溶解气体本身的积累,渗透压的变化,pH值的变化,甚至这三个因素的结合。

其他胶体或热力学性质,如培养基本体粘度、乳液稳定性、产品或生物质沉降,也可能受到压力等因素的影响。对培养的不利影响也可能在产品收获过程中持续存在,影响下游工序的效率和质量(如固液分离、色谱、萃取、结晶、蒸馏、聚合),导致生产成本上升,产品质量下降。


化学应力

随着生物反应器体积的增大,混合时间从几秒(实验室规模)增加到几分钟(数百立方米)。此外,其他生物反应器内部部件,如火花、挡板和冷却盘管,会造成混合、传热和气液传质不良的死区。在大规模生产过程中,不完全混合导致微环境和不均匀性,导致生物过程参数如pH、温度、溶解氧(DO)、dCO2和营养物质浓度的梯度。综合起来,这些变化可能导致暂时性或永久性的损害,如氧化损伤、营养限制和其他应激反应,从而降低微生物的生存能力、稳定性和生产力。

在大规模的工业培养中,由于原料和微生物污染而产生额外的化学应力。为了降低生产成本,许多生产过程使用未经精制或很少精制的原材料,从而将在肉汤中积累的杂质引入抑制/有毒水平。这些真实的原料包括玉米浆、玉米浸泡液、甘蔗汁、糖蜜、甜菜汁、农业残留物、食品加工废弃物、城市固体废弃物和废气。微生物污染的原料、苛刻的原料预处理条件、微生物污染的培养等可进一步提高有害杂质的水平,降低产品滴度率产率(TRY)指标。这些因素可以而且应该在宿主菌株的选择和菌株筛选试验中得到解决,但是优先级可能被低估,因此在菌株/培养发展计划的早期阶段敏感性研究不足,在小规模筛选和优化中通常使用无菌技术和非常纯的原料。如果菌种工程和菌种筛选能够从一开始就考虑到这些风险并减轻它们,那么过程规模将变得更加可预测,特别是在开发新的微生物作为生产平台的情况下。


系统生物学方法可以产生可操作的知识,以解决规模相关因素的影响

在大型发酵罐中暴露在非均质条件下,可以触发生产微生物的遗传和生理反应。高通量分析,如自动化DNA测序和-组学技术(通量组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学),以及高通量筛选平台,使这些能够通过在规模缩小的实验室实验中模拟工业条件来表征。大型发酵罐的数学模型对设计规模化条件和预测大规模环境下小规模学习的影响具有重要的指导意义。这种方法增加了关键性能指标(如TRY)从实验室完全快速转换到制造工厂的可能性,从而将启动成本最小化。在这种背景下,研究了气体混合、基质和养分的不均一性,以及微生物种群的固有不均一性。


气体混合

气体混合,如CO2和O2,是导致生物反应器中微生物细胞反应可测量差异的一个关键参数。在分批培养的重组大肠杆菌培养液中,随着培养液中dCO2浓度的增加,生长速度变慢,副产物积累增加。一项研究发现,波动dCO2增加大肠杆菌产生绿色荧光蛋白(GFP) 所需的时间。


培养基与养分异质性

在大型生物反应器中,不完全混合除了会导致非最优的气体传输效果外,还会对生物反应器培养物施加基质供应梯度。最近的研究结果表明,大肠杆菌可以采取短期和长期策略,以承受有关改变营养有效性的应激条件。


表型和遗传异质性

基因表达的随机性通常被认为是微生物群体表型异质性的主要来源,这是由于启动子表达的细胞间变异、转运蛋白分布不均或在生长二次曲线的不同阶段。对于在大型生物反应器中生长的细胞,这种固有的异质性可能会因与混合不足相关的新兴亚群而加剧。营养水平的混合不良或振荡会导致不同代谢状态的细胞亚群,进而影响天然代谢通路的活性。例如,由静止和非静止细胞群组成的静止期培养物可能具有不同的基因表达和呼吸谱,因此相对于同一种培养物,其生产水平也不同。


大型生物反应器中稳定可靠生产菌株的工程方法

一种用于大规模生产的工程菌株的系统方法首先需要设想大规模生产条件,以便在小规模上模拟这些条件,然后筛选将满足相关要求的宿主/途径组合。化学抑制(由培养基成分、代谢物和产品引起)和生产对生长的依赖是可以通过系统和合成生物学方法在小规模筛选环境中解决的两个问题。


耐受工程和生长耦合生产

利用有针对性的和组合的方法,有大量例子对微生物菌株进行工程改造,以提高其对原材料、代谢中间体、副产品和最终产品的耐受性。耐受工程的蛋白靶点从伴侣蛋白到转运蛋白,可以通过筛选自然多样性或定向进化实验来确定。由于耐受性表型需要与生产表型关联,半定向方法也被开发出来,通过改造转录因子和全局调控因子等获得表型。全基因组的耐受工程方法包括实验室进化,这种新兴方法的一个复杂版本是自动化实验室进化(ALE)。

产品耐受和生产增长依赖性是菌株工程中的相关概念。如果生产不依赖于生长需求,由于繁重通路的表达和/或抑制化合物的生产而产生的生长抑制可导致菌株由于选择优势而偏离其最佳生产表型。因此,在生产与生长要求无关的情况下,对应力和抑制剂耐受性增强的工程菌株是至关重要的。然而,如果可以应用,将生长与生产结合起来是进化菌株以保持高滴度、速率和产量的强大策略。例如,Optknock®工具使用代谢模型来识别结合生长和产品生物合成的基因缺失目标,使目标化合物的生产成为必需。Optknock®方法来预测基因在大肠杆菌中删除成功耦合琥珀酸生产过剩增长是系统生物学辅助菌株改进的一个例子,使用类似的工具,较大影响,克服最终产品的生产是一个例子毒性尝试满足商业目标使用大肠杆菌作为生产宿主。新兴的应用程序寻求将生长耦合生产与实验室进化实验相结合,利用这两种强大的方法快速生成高产菌株,以保持所需的表型。


生长解耦合生产

对于某些代谢目标,不可能将目标代谢与生长依赖进行生物化学耦合。在其他情况下,有效的生长耦合可能局限于一定的培养条件。因此,需要选择压力来维持生产途径,避免以牺牲产量为代价来选择生长更好的菌株。在这些情况下,将增长与生产脱钩被视为在生产过程中保持稳定菌株性能的另一种策略。

将生长与生产分离的一种方法是,只有在培养物达到细胞密度阈值或静止期后才激活生产途径。响应细胞内抑制剂的动态激活通路、细胞密度和营养物质也被用于解耦方法。最近,一种合成生物学方法将基于群体感应和基于生物传感器的系统结合起来,对两种不同的酶进行相互独立和可调的动态调节,以提高大肠杆菌中d-葡萄糖酸的产量,从而使该化合物的效价最高。


生物传感器/生物控制器

生物传感器,如RNA适配体或与小分子结合并引发转录或变构反应的蛋白质,是关键的合成生物学工具。如前几节所述,生物传感器的应用范围从报告细胞反应的代谢状态或异质性到耦合调节,从而实现对压力的动态响应。已经发现并成功开发了多种生物传感器,它们可以在没有诱导剂的情况下,调控基因的最佳表达,减少抑制中间体或有毒蛋白。生物传感器和相应的调控因子通过响应代谢开关来控制通路。生物传感器也被用来整合多个信号。这些复杂的生物传感器线路可用于复杂的反馈调节,以维持工程系统在异构生物反应器环境中的响应。在使用这些设计的系统时,一个潜在的陷阱是,使用生物传感器来调节通路或开发报告系统的线路会受到细胞生理学和与其他合成线路的交叉干扰。这些缺点已经开始通过自动化基因线路设计平台来解决,使线路的构建彼此隔离,呈现出一个新的和具有挑战性的研究领域。


系统和合成生物学方法提供数据的工具

与微滴定板和摇瓶不同,仪器完善的生物反应器提供DO和气体代谢的实时测量,用于计算氧转移率(OTR)、氧吸收率(OUR)、二氧化碳演化率(CER)和呼吸商(RQ)。这些参数是代谢活动的代表,可以通过调节空气流量和营养进给量来控制。然而,这些测量是基于液相和气相的生物反应器,并不能充分代表各种细胞状态的潜在异质性培养。因此,对实验室规模和生物反应器培养物的多组学比较可以帮助识别放大性能的其他指标,例如基因漂移、代谢物水平的差异、蛋白质稳定性变化、氧化损伤和基因表达干扰。反过来,这些指标可以应用于实验室规模的菌株工程,以获得更可预测的放大性能。生物反应器提供了一个时间序列测试的机会,由于更高水平的过程测量和控制。然而,由于生物反应器操作是昂贵的,测试过程条件的范围可能是非常有限的。生物反应器实时测量数据的协同分析,以及多组学方法,可以提供关于生长和生产性能敏感性的大量信息。


将商业规模的培养条件和相关的高成本效益、高通量能力小型化,可以显著增加在实验室规模上测试的参数数量。这使得测试新主机在不同规模下的性能成为可能。然而,传统的过程开发统计实验设计(DOE)方法常常受到研究人员对商业规模条件理解的限制。选择的测试参数的质量也应随着测试参数的数量而提高。


结束语

许多研究工作现在集中在开发应对特定于工业规模扩大挑战的菌株。Genomatica宣布使用其技术生产的生物丁二醇超过10000吨,这是一个关键的里程碑,既展示了系统菌株工程,也展示了跨学科工具的应用,以实现工业生物基生产。

在目前的技术状态下,合成和系统生物学工具越来越能够在生物反应器中描述工业相关条件下的菌株生理学。目前已经有各种方法来设计或进化在这些条件下是鲁棒的菌株,包括将生产表型与生长相结合的方法。菌株设计、菌株构建和高通量测量的小型化和自动化提供了数据和数据驱动的方法,将生产性能从实验室转化为试点和商业规模。采用先进的统计方法,如机器学习,可以加快菌株工程周期,目前正被专注于高通量菌株工程的生物技术行业采用。

近年来,各类生物产品微生物平台的建立,为更快速地引进更多研发投入和风险更低的新产品提供了良好的前景。合成和系统生物学工具可作为评价该菌株在生物反应器的工业相关条件下的性能适应性的起点。随着我们对生物过程的机械学理解的加深,以及我们使用大型系统收集数据集的能力变得更加复杂,微生物转化可以为大宗商品、材料、食品、药品和燃料的大规模生物制造提供强大的可实现的解决方案。